【文獻分享】一種NT-proBNP替代抗原的成本效益優化策略

Ruan Y等人提出了一種構建NT-proBNP替代抗原的策略。以第10人纖維連接蛋白III型（FN3）為蛋白支架，將編碼NT-proBNP兩個抗原表位的堿基序列通過4GS或polyN連接體融合到FN3的FG環區和C端，再用大腸桿菌表達系統對融合蛋白（分別命名為FN3-epitopes-4GS和FN3-epitopes-polyN）進行低成本的表達和純化。Western blot分析、ELISA、血清穩定性測試和差示掃描量熱分析等一系列檢測結果表明，FN3可用于構建雙抗原表位、且具有良好免疫反應性的穩定NT-proBNP替代抗原。利用大腸桿菌表達系統可高效生產FN3 NT-proBNP替代抗原且成本低，該策略在生物大分子替代抗原的生產方面具有潛在的應用前景。

1.為什么要做NT-proBNP替代抗原

N末端腦利鈉肽前體（NT-proBNP）在人血清中的濃度很低，且經常被其他高濃度的蛋白污染，細胞培養成本高且容易降解，因此想要純化天然NT-proBNP制備標準抗原并不容易。

2.為什么選擇FN3做支架蛋白制備替代抗原

第10人纖維連接蛋白III型（FN3）是開發非抗體結合域特別成熟的支架，被廣泛應用于工程化新型結合蛋白；一些基于FN3的生物分子已被開發用于臨床治療和診斷。FN3具備以下特點：

1）結構簡單
2）N端或C端非常靈活，可以在不破壞附近結構二級構象的情況下延伸，被認為是一個合理、規則的抗原表位區域。
3）不含二硫鍵或游離巰基，有助于其在高溫（Tm =87°C）和還原環境的穩定性。
4）三個靈活的表面環結構（BC、DE和FG）與抗體可變區相似，BC和FG環中氨基酸序列的變化不會影響FN3大分子衍生物的穩定性。據報道，FG環的氨基酸序列可以耐受高度人工引入的序列多樣性，且不會改變衍生物的穩定性或溶解度。
5）FN3缺乏半胱氨酸殘基，可在大腸桿菌等細菌的細胞質中高表達。
FN3獨特的結構特征、優越的生物物理特性及其與許多分子的相容性為制備檢測試劑盒中穩定替代抗原提供了有利條件。

3.設計思路

抗體與靶標的結合大多是高度特異性的。因此，一種抗體只能識別抗原的特定部分——“抗原表位”。抗原表位的展示是體外生產替代抗原的關鍵步驟。研究表明，線性表位與不連續構象表位不同，是由氨基酸序列而不是三維形態決定的。因此，將特定的線性抗原表位偶聯到大分子載體上替代全長抗原作為免疫原是一種可行的方法。目前NT-proBNP免疫的確切線性表位得到了很好的研究，可以通過穩定的支架蛋白（如FN3）融合表達NT-proBNP的短線性表位肽，并利用大腸桿菌表達系統以低成本促進生產、純化和檢測。

3.1NT-proBNP表位的選擇

無論是在人類血液中還是在真核細胞中重組表達的NT-proBNP分子，中心部分都存在o糖基化修飾。因此，建議使用NT-proBNP的N端或C端特異性抗體對血清NT-proBNP進行精確定量測量。此外，有報道稱NT-proBNP分子中心部分（28-45和46-60肽）的特異性抗體在免疫測定中很少與人血液樣本中的抗原結合。本研究選取NT-proBNP兩端的表位（線性表位12-21和62-73）工程化FN3。

3.2 NT-proBNP表位插入位點的選擇

選擇FN3晶體結構中相距較遠的C端和FG環，以減少相鄰兩個抗原表位之間局部構象的影響，還可通過靈活的連接體[如polyN（SSNNNNNNNNNN）或4GS（GGGGS）]將表位分開。

4.核心試驗概述

4.1質粒構建

首先合成編碼支架蛋白FN3的基因（其FG環和C端被NT-proBNP的兩個表位取代）。通過NcoⅠ和HindⅢ位點克隆到pET28a(+)載體上。此外，編碼4GS連接子或polyN連接子的基因被引入表位62-73上游，產生兩個相似但不同的質粒[命名為pET28a (+)-FN3-epitopes-4GS和pET28a (+)-FN3-epitopes-polyN]。DNA測序結果顯示表位DNA和連接子成功插入質粒。

4.2同源性建模

為了獲得末端線性表位的三維結構，利用RaptorX （http://www.raptorx.uchicago.edu/）進行同源性建模。首先從RCSB PDB數據庫（PDB:1FNA）中檢索FN3的氨基酸序列，以作為同源性建模的靶點。利用RaptorX進行蛋白質二級結構預測和基于模板的三級結構建模。最后在PyMOL中對兩個蛋白結構進行比對（The PyMOL Molecular Graphics System，版本1.5.0.3)。

4.3蛋白質的表達和純化

為制備顯示NT-proBNP兩個表位的重組FN3蛋白（簡稱FN3-epitopes），將質粒pET28a(+)-FN3-epitopes-4GS或pET28a(+)-FN3-epitopes-polyN轉入大腸桿菌BL21（DE3）。挑取單個菌落，將培養物以1/100的比例接種于含卡那霉素的LB培養基中，37℃過夜培養。OD600達到0.4-0.6時，加入0.2mM異丙基β-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG），在 25℃搖床上繼續培養，誘導FN3-epitopes表達，6小時后離心收集細胞。細胞經超聲破碎，12000g離心后即可獲得粗產物。將含有目標蛋白的細胞裂解上清液在40°C下加熱10min。然后高速去除沉淀，獲得上清液，加入到HisTrap™HP中進行純化。通過SDS-PAGE或Western blot分析檢測目標蛋白的表達和純化情況，用BCA檢測試劑盒測定蛋白濃度。

4.4驗證

研究團隊進行了熱變性實驗、Western Blot分析、可溶性蛋白檢測、抗原結合能力的評價、差示掃描量熱法（DSC）及FN3-Epitopes-polyN血清穩定性試驗（詳細信息見原文）。

5.結果

5.1FN3-Epitopes的結構

選擇NT-proBNP表位序列12-21和62-73，在FN3空間結構上距離相對較遠的兩個位置（FG環和C端）分別植入，以避免兩個表位之間可能發生的相互作用。FN3 FG環區氨基酸序列RGDSPASSK被NT-proBNP表位12-21取代，NT-proBNP的62-73表位與FN3的C端重組。此外，在FN3結構域引入polyN （SSNNNNNNNNNN）或4GS（GGGGS）連接子，將NT-proBNP兩個表位融合到FN3結構域，以保證靶蛋白的正常功能，重組蛋白分別命名為FN3-epitopes-polyN和FN3-epitopes-4GS（圖1）。額外的連接子KKGKGKKGK，可以促進重組蛋白（FN3-epitopes，即FN3-epitopes-polyN和FN3-epitopes- 4GS）與其他分子的偶聯，如生物素和過氧化物酶。

圖1. FN3、FN3-Epitopes的部分序列和結構

注：（A）NT-proBNP表位修飾的FN3蛋白部分序列。綠色字母代表FN3的FG環（RGDSPASSK）區域或C端（EI），紅色字母代表FG環插入的NT-proBNP表位12-21 （LETSGLQEQR）或C端插入的表位62-73 （RGHRKMVLYTLR）。灰色字母表示插入的4GS連接子或polyN連接子。（B）FN3的三維結構（青色）和NT-proBNP表位序列重組的FN3建模結構（表位12-21和62-73用紅色線表示），4GS連接子或polyN連接子用深灰色線表示。FN3的骨架是青色的，它與黃色的同源模型重疊。

5.2FN3-Epitopes的表達

重組FN3-epitopes可被針對NT-proBNP不同氨基酸殘基（13-27和61-76）的商業單克隆抗體識別。SDS-PAGE結果顯示重組蛋白FN3-epitopes-polyN（16.7kDa）和FN3-epitopes-4GS（14.5kDa）在IPTG誘導的T7啟動子的控制下表達（圖2A，圖2B）。Western blot分析表明，重組蛋白FN3-epitopes能夠與所選抗體特異性結合（圖2C，圖2D）。

圖2. 重組FN3-Epitopes在大腸桿菌中的表達

注：（A, B）誘導1-6小時后，通過SDS-PAGE分析蛋白FN3-epitopes-4GS （A）和FN3-epitopes-polyN （B）的表達情況，箭頭所指為靶蛋白。（A, B）的右側為SDS-PAGE圖像的信號強度，數據為獨立實驗的平均值，誤差條表示標準差。（C, D）Western blot分析FN3-epitopes-4GS（上圖）和FN3-epitopes-polyN（下圖）在指定誘導時間點的表達情況，（C）和（D）分別使用HRP標記的NT-proBNP（表位13-20）和NT-proBNP（表位63-71）抗體。（A, B,C, D）中的M為Marker。

5.3FN3-Epitopes的純化

FN3-epitope在大腸桿菌中主要以可溶性形式表達（圖3A，圖3B）。在相似蛋白表達水平下，蛋白FN3-epitopes-4GS的純化效率明顯低于蛋白FN3-epitopes-polyN（圖3C，圖3D）。此外，為便于親和層析純化，研究人員進行了熱變性實驗，檢測不同溫度條件下（37-70℃）FN3-epitopes-polyN蛋白的降解水平。結果表明，隨著溫度的升高，FN3-epitopes-polyN蛋白逐漸從上清轉移到沉淀。在40℃下，大約30%的異源蛋白析出，而60%的目標蛋白仍存在于上清中（圖3E，圖3F；詳細信息見補充圖1）。利用這種熱穩定性，研究人員優化了純化工藝，將FN3-epitopes-polyN細胞裂解液的上清加熱到40°C，然后在進行金屬螯合層析，從而獲得更高質量的純化蛋白（~ 40mg/L）。SDS-PAGE結果顯示，重組蛋白FN3-epitopes-polyN的純度約為100%（圖3D）；這些蛋白無需進一步純化，可作為校準品或標準品。

圖3. 重組FN3-epitopes的溶解性和純化

注：（A,B）分別為大腸桿菌BL21（DE3）中表達的可溶性FN3-epitopes-4GS（上圖）和FN3-epitopes-polyN（下圖）的SDS-PAGE和Western blot結果。箭頭所指為靶蛋白FN3-epitopes-4GS（14.5kDa）或FN3-epitopes-polyN（16.7kDa）。Lane 1為總蛋白裂解物的沉淀；Lane 2為總蛋白裂解液上清。（C, D）為通過HisTrap™分離純化FN3-epitopes-4GS（C）和FN3-epitopes-polyN（D）的SDS-PAGE結果。（C）中Lane 1-3的蛋白用60mM咪唑依次洗脫；（D）中Lane 1-3的蛋白用80mM咪唑依次洗脫。（E, F）為FN3-epitopes-polyN（E）和除FN3-epitopes-polyN外的其他蛋白（F）的熱降解直方圖，數據為獨立實驗的平均值，誤差條表示標準差。（A, B,C, D）中的M為Marker。

補充圖1. SDS-PAGE分析不同溫度條件下的熱降解檢測

注：目標蛋白用黑框圈出。上圖為上清液中總蛋白。下圖為沉淀物中的總蛋白質。M為Marker。

5.4FN3-Epitopes的抗原反應性

以野生型FN3為陰性對照，采用雙抗體夾心ELISA法系統評價重組FN3-epitopes-polyN和FN3-epitopes-4GS的免疫反應性。結果顯示兩種重組FN3-epitopes與特異性抗體均具有良好的線性關系，其中FN3-epitopes-polyN在0.06~12.85ng/ml范圍內，標準曲線r2大于0.99（圖4B, 補充圖2）。與FN3-epitopes-4GS相比，FN3-epitopes-polyN在低濃度下表現出更好的親和力。綜上所述，NT-proBNP的雙表位可以在FN3結構域上成功展示，并保持其原有的高抗原反應性。本研究重點分析了易于純化和親和力較好的重組蛋白FN3-epitopes-polyN。

圖4. 重組蛋白FN3-epitopes-polyN的免疫反應性和穩定性檢測

注：（A）夾心ELISA方案。（B）夾心ELISA法檢測免疫反應性。捕獲和檢測抗體分別為NT-proBNP（表位63-71）和酶標NT-proBNP（表位13-20）抗體，底物溶液為TMB。（C）Western blot分析血清FN3蛋白（上圖）和FN3-epitopes-polyN（下圖）的穩定性。（D）DSC熱穩定性檢測顯示，FN3-epitopes-polyN（Tm= 83.9°C）和野生型FN3（Tm= 84.9°C）具有相似的高Tm值。

補充圖2. 夾心ELISA檢測抗原反應性

注：捕獲抗體為NT-proBNP（63-71）抗體（3.5μg/mL），檢測抗體為酶標NT-proBNP（13-20）抗體（0.35μg/mL），底物溶液為TMB，檢出限為0.06ng/mL。

5.5FN3-Epitopes-polyN的體外穩定性

為了明確兩個額外表位的融合是否對重組蛋白的穩定性有影響，研究人員進一步驗證了FN3-epitopes-polyN的血清穩定性和熱穩定性。體外重組蛋白FN3-epitopes-polyN的血清穩定性檢測是在正常人血漿中進行的。結果表明，與非工程化FN3相似，在正常人血漿中37℃孵育80 h后，FN3-epitopes-polyN降解（圖4C）。DSC結果顯示，FN3-epitopes-polyN蛋白檢測只有一個單峰（Tm=83.9°C），且與野生型FN3的Tm值相近（Tm=84.9°C），說明純化后的FN3-epitopes-polyN蛋白保持了非工程化FN3的穩定性（圖4D）。上述穩定性試驗表明，重組蛋白FN3-epitopes-polyN將是NT-proBNP抗原的高度穩定替代品。

6.總結

基于支架蛋白構建替代抗原是一種很有前景的成本效益優化策略。本研究以N末端腦利鈉肽前體（NT-proBNP）的兩個肽表位為例，提出了構建第10人纖維連接蛋白III型（FN3）替代抗原的策略。結果顯示，基于FN3支架構建的NT-proBNP替代抗原具有與NT-proBNP相同的免疫反應性、良好的生物物理特性和穩定性；可以在大腸桿菌表達系統中快速高效地產生，相較于真核細胞表達或化學合成操作更簡單、成本更低。

參考文獻

Ruan Y, Chao S, Hu X, et al. FN3 Domain Displaying Double Epitopes: A Cost-Effective Strategy for Producing Substitute Antigens[J]. Front Mol Biosci, 2021,8:742617.?

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